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HPLC 到闪式快速色谱方法转换

 发布时间:2021-06-08 点击量:306

​摘要

    Teledyne ISCO 分析色谱柱在ACCQPrep®  HPLC 系统通过一次简单的Z查运行即可生成分离方法。该流程不仅能匹配RediSep® HPLC色谱柱,也匹配RediSep Gold®金标快速色谱柱,这意味着用户可以同时开发闪式快速色谱的方法。来自其他供应商的C18色谱柱也可以用于方法开发,但与RediSep色谱柱相比,选择性可能稍微存在差异,这意味着出峰时间可能不一定会在预期的时间被洗脱。在本应用报告中描述的方法放大流程是有效的,只需将时间转换成柱体积,因为一个化合物在某个特定溶剂组份的洗脱时间是特定的。另一种方法是使用ACCQPrep HP150使用RediSep Prep色谱柱和内置在系统中的聚焦梯度发生器,从侦测运行中快速创建聚焦梯度(参考应用报告AN119)。

 

实验仪器和色谱柱

    分析HPLC系统和表1中列出的色谱柱。

    如果需要溶剂改良剂,同样的改良剂需同时应用于高效液相色谱仪和闪式快速制备系统,挥发性改进剂在纯化后更容易从样品中去除。

实验结果和讨论

    对于闪式快速色谱,Shou选洗脱时间约6个柱体积(CV),当转换为CV单位时,很容易将uHPLC梯度从一个色谱柱放大到另一个色谱柱。

    三段线性梯度效果很好,第一段为12 个CV,目标化合物洗脱在中间,约6个 CV,不管怎样,起始和结束溶剂组成是洗脱化合物所需要的。由于HPLC系统驻留死体积的原因,没有必要在运行开始时等度保持,相对于柱体积和HPLC驻留死体积的大小,运行CombiFlash®NextGen梯度时,目标化合物可能提前或稍微滞后被洗脱。添加一个0.01分钟时长的步骤,然后以100% B清洗色谱柱中清除残留化合物。

    每段长度(以分钟为单位)的计算方法是用梯度长度乘以柱体积,然后除以流速。梯度表是通过将分段长度加到前几次的总和而得到的。在表2中,柱体积中的片段长度被转换为时间,并将添加的片段长度形成梯度表。

    如果方法的分离度可以接受,使用相同的梯度表很容易创建一个闪式快速的梯度,用于以CV为单位的CombiFlash仪器。

结果

    下面显示的运行使用了表2中列出的梯度片段。一次运行使用2 × 50mm C8色谱柱,另一次使用4.6 × 150mm C18色谱柱。Benzophenone在水/乙腈体系的梯度洗脱。

C8, 2x50 mm 运行实例

    在RediSep Prep C8 2 x 50 mm色谱柱上开发的方法,3分钟内,梯度为40% - 50% B,然后一步升到100% B,使用水/乙腈体系清除色谱柱中的杂质。

    化合物洗脱时间为2min或7.9 CV。然后样品在50 g RediSep Rf Gold C8柱(PN 69-2203-712)上运行,使用相同的梯度,和已确定的柱体积。

    闪式快速色谱柱的洗脱与uHPLC柱的洗脱非常接近,表明该方法可以通过这种方式转移。

C18, 4.6 x 150 mm 运行实例

    在4.6 × 510mm RediSep Prep C18色谱柱上建立了的方法

    使用水/乙腈体系,在18分钟内,梯度为50% - 60% B,然后一步升到100% B,以从色谱柱中清洗污染物。C18比C8具有更强的保留能力,因此在柱体积相同的保留时间下,需要更强的溶剂体系才能得到洗脱。

    该化合物在11.9min或7.9 CV洗脱。将方法转移到50 g RediSep Rf Gold C18色谱柱(PN 69-2203-336)上运行,水/乙腈体系中。

    再一次表明,闪式快速色谱柱与分析用高效液相色谱保留有很好的一致性。

    值得注意的是,从uHPLC色谱柱转换的方法在闪式快速色谱柱洗脱比预测保留时间稍早,而HPLC预测的洗脱时间比实际闪式快速色谱柱洗脱时间稍早。这是因为在计算中没有考虑系统驻留死体积。

    uHPLC和HPLC色谱柱在同一分析仪器上运行,分析系统驻留死体积相对于uHPLC柱更大,但相对于4.6 mm色谱柱较小,因此不同运行时间梯度延迟的程度不同。在分析过程中,最好使目标化合物的洗脱在梯度的中间,以允许不同仪器之间保留体积一定的变化。 

 

结论

    RediSep Prep色谱柱可以可靠地用于开发闪式快速色谱的方法,2 × 50mm uHPLC色谱柱是非常快速的方法开发手段,运行基本在5分钟内完成。两种色谱柱都需要极少量的样品,节省几乎所有的待纯化样品。
 


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