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受阻、非标准氨基酸的微波辅助多肽固相合成

 更新时间:2022-12-29 点击量:613

摘要

  • 微波增强的多肽固相合成(SPPS)能够快速有效地进行大体积氨基酸(如Aib N-Me-A)的常规困难偶联。

  • 酰基载体蛋白衍生物 VQAibAibIDYINGOH  VQ(N-Me-A) (N-Me-A)IDYING-OH 的合成在 2 小时内完成,纯度分别为95% 和 86%。

  • GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2 的合成在 3 小时内完成,纯度为 89%。

介绍

在许多生物学相关的化合物中都可以找到受阻的非标准氨基酸,例如 α-氨基异丁酸 (Aib) N-甲基丙氨酸 ((N-Me)-A)(图 1)。1-3 然而,包括 Aib  N-甲基化氨基酸已被证明具有挑战性;第二个甲基引入的空间位阻,无论是在 α-碳还是酰胺氮上,都使得在常规 SPPS 中偶联这些氨基酸衍生物变得困难。

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1:位阻、非标准氨基酸

然而,通过使用微波增强的SPPS,与受阻非标准氨基酸相关的困难已被最小化。 SPPS 中使用微波能量可以快速有效地完成大体积氨基酸(如 Aib N-甲基丙氨酸)的常规困难偶联 4,5

材料和方法

试剂

N-α-Fmoc-α-氨基异丁酸获自 AnaSpec (Freemont, CA) Fmoc-N- Me-Ala-OH 获自 Peptides International (Louisville, KY)。所有其他氨基酸均获自 CEM Corporation (Matthews, NC),并含有以下侧链保护基团:Asn(Trt)Asp(OMpe)Gln(Trt)Glu(OtBu)Lys(Boc)Ser( OtBu) Tyr(tBu) Oxyma Pure Rink Amide ProTideTM LL  CEM Corporation (Matthews, NC) N,N-二异丙基碳二亚胺 (DIC) CreoSalus (Louisville, KY) Fmoc-Gly-Wang Resin LL  NovaBiochem (St. Louis, MO)。哌啶获自 Alfa Aesar (Ward Hill, MA)。三氟乙saun (TFA)3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三异丙基硅烷 (TIS) 和乙酸购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷 (DCM)N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 和无水乙mi (Et2O) 购自 VWR (West Chester, PA) HPLC    (H2O)    HPLC   (MeCN) Fisher Scientific (Waltham, MA)

多肽合成:GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2

使用CEM Liberty Blue™ 自动微波肽合成仪在Rink Amide ProTide LL 树脂(离子交换容量: 0.18 meq/g)上以 0.1 mmol规模制备多肽。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DICDMF中的Oxyma Pure 和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT  CEM Razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后,肽在无水乙mi中沉淀并冻干过夜。

多肽合成: VQAibAibIDYING-OH

使用 CEM Liberty Blue 自动微波肽合成仪在  FmocGly-Wang  LL 树脂(离子交换容量:0.33  meq/g上以  0.1  mmol   规模制备肽。用哌啶和  Oxyma  Pure    DMF  中进行脱保护。使用DMF 中的 DICDMF 中的 Oxyma Pure  5 倍过量的 Fmoc- AA-OH 进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT  CEM Razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后,肽在无水乙mi中沉淀并冻干过夜。

多肽合成:VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH

使用 CEM Liberty Blue 自动微波肽合成仪在  FmocGly-Wang  LL 树脂(离子交换容量:0.19  meq/g上以  0.1  mmol   规模制备肽。用哌啶和  Oxyma  Pure    DMF  中进行脱保护。使用DMF 中的 DICDMF 中的 Oxyma Pure  5 倍过量的 Fmoc- AA-OH 进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT  CEM Razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后,肽在无水乙mi中沉淀并冻干过夜。

多肽分析

在配备有  PDA  检测器的   Waters   Acquity   UPLC   系统上分析肽,该检测器配备 Acquity UPLC  BEH  C8  柱(1.7  mm     2.1 x  100  mmUPLC  系统连接到  Waters  3100   Single   Quad MS   用于结构测定。   Waters   MassLynx    软件上进行峰分析。使用 (i) H2O   (ii)  MeCN  中的  0.1%  TFA  梯度洗脱进行分离。

结果

Liberty Blue 自动微波肽合成仪上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增强  SPPS  产生了  89%  纯度的目标肽(图2)。

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2:GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2HPLC色谱图

Liberty Blue 自动微波肽合成仪上的 VQAibAibIDYING-OH 的微波增强 SPPS 产生了纯度为 95% 的目标肽(图 3)。

受阻图片3.png

3: VQAibAibIDYING-OHHPLC色谱图

Liberty Blue 自动微波肽合成仪上的VQ(N-Me-A)(N-Me- A)IDYING-OH 的微波增强 SPPS 产生了纯度为 86% 的目标(图 4)。

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4:VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OHHPLC色谱图

结论

微波增强的SPPS能够快速有效的进行大体积氨基酸(如Aib和N-Me-A)的常规困难偶联。常规合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2 需要40小时且纯度 < 10%,但微波增强 SPPS 3 小时内产生目标肽且纯度为 89% 此外,酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH 的合成在 2 小时内完成,纯度分别为 95% 86% 微波增强的 SPPS 已被证明是一种有效的工具,可以最大限度地减少SPPS受阻的非标准氨基酸相关的困难。

参考文献

[1] Mueller, P.; Rudin, D. O. Nature. 1968, 217, 713–719.

[2] Rebuffat, S.; Goulard, C.; Hlimi, S.; Bodo, B. J. Pept. Sci. 2000, 6, 519–533.

[3] Ahmed, G.; Elger, W.; Meece, F.; Nair, H. B.; Schneider, B.; Wyrwa, R.; Nickisch, K. Bioorg. Med. Chem. 2017, 25, 5569–5575. Collins, J. M. Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics. In Microwaves in Organic Synthesis, Third Edition; de la Hoz, A.; Loupy, A.; Wiley-VCH: Weinheim, 2012; 897–959.

[4] Ben Haj Salah, K.; Inguimbert, N. Org. Lett. 2014, 16 (6), 1783–1785.