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【CEM Liberty】全自动微波增强蛋白质全合成

 更新时间:2024-02-22 点击量:530

摘 要


使用微波增强的固相多肽合成(SPPS)技术和Liberty Blue™ 2.0以及Liberty PRIME™ 2.0可以快速高效地合成蛋白质和长肽。优化后的微波SPPS结合了一种新的顶部冲洗技术,可以实现更高纯度的蛋白质序列合成。这项技术已经通过一系列生物相关蛋白质(如泛素、巴氏蛋白、胰岛素原、胶原、HIV蛋白酶和MDM2)的合成得到验证,这些蛋白质含有76-127个氨基酸,通过逐步组装获得良好纯度,无需任何连接步骤。通过在Prodigy™制备型HPLC肽纯化系统上以60°C的高温色谱法从粗制品中分离出高纯度样品。



引 言


蛋白质和长肽在生物体系中扮演着至关重要的角色,并且它们是许多重要治疗药物的构成要素。然而,这些生物分子的研究进展常常受到基于时间密集型表达技术和原生化学连接方法的限制。固相多肽合成(SPPS)为直接合成具有特定序列的蛋白质提供了一种途径,并能够迅速产生结构类似物。尽管如此,由于在合成过程中杂质的累积和产物聚集的倾向,长肽和蛋白质的SPPS合成面临着不小的挑战。在早期,SPPS主要被应用于生产较短的片段,以便进行原生化学连接,而对于较长序列的合成能力相对受限[1]。近来,快速流动式合成方法展示了其以极短周期时间组装长序列的显著潜力。但这种方法的一个缺点是,它需要使用大量的氨基酸(通常是≥ 100当量),并且伴随着大量废物的产生。


微波加热技术现在已经被普遍应用于多肽合成,并且已经证实其能够有效地克服肽链聚集的难题,并促进困难反应的顺利进行[3,4]。通过结合优化的碳二亚胺耦合条件和微波加热(CarboMAX™ 技术),可以实现最小程度的差向异构化,并且与传统使用鏻盐和强碱的更为激烈激活方法相比,能够实现更高纯度的合成效果。此外,采用无需中间排放步骤的一锅法耦合和脱保护流程,使得整个过程更加迅速和高效。


在2022年,推出了新一代的微波肽合成器系列——Liberty PRIME 2.0和Liberty Blue 2.0。这些先进设备采用了创新的顶部冲洗技术,该技术在肽合成过程中能够保持反应容器表面的清洁度。通过预防挥发性试剂的再冷凝,顶部冲洗技术有效避免了对后续反应的污染。随着长蛋白质合成的进行,每个反应步骤中即使是微小的纯度提升也会累积起来,最终转化为整体纯度的显著提高。利用Liberty PRIME 2.0,成功合成了一系列具有挑战性的蛋白质,包括76个氨基酸的泛素、86个氨基酸的胰岛素原、89个氨基酸的巴氏蛋白、99个氨基酸的类胶原蛋白序列和HIV蛋白酶,以及127个氨基酸的MDM2。


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图1. Liberty PRIME 2.0


蛋白质合成流程经过精心优化,仅需要10到20当量的氨基酸,平均每个合成周期只需大约7.5分钟,这样的高效率使得目标蛋白可以在一晚上的时间内(每轮运行10至17小时)以较高的初始纯度完成合成。到了第二天,所合成的蛋白质便被分离并转移到Prodigy纯化系统,在那里它们通过60°C的升温色谱法得到进一步净化。这一㐬程不仅速度迅捷,而且试剂的使用也木及具效率(详见表1)。



材料与方法


试 剂


从CEM Corporation(Matthews, NC)获得的以下Fmoc氨基酸包含所示的侧链保护基团:Ala, Asn(Trt), Arg(Pbf), Asp(OMpe), Asp(OtBu)-(Dmb)Gly, Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Gly, His(Boc), Ile, Leu, Lys(Boc), Phe, Pro, Met, Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), 和 Val。Rink Amide ProTide™ LL树脂(0.20 meq/g替代)也来自CEM Corporation。N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、吡咯烷、三氟乙酉夋(TFA)、3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇(DODT)和三异丙基硅烷(TIS)来自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙酉迷(Et2O)和乙酸来自VWR(West Chester, PA)。LC-MS级水(H2O)和LC-MS级乙腈(MeCN)来自Fisher Scientific(Waltham, MA)。



蛋白质合成


蛋白质合成在CEM Liberty PRIME 2.0自动化微波肽合成仪上进行,采用Rink Amide ProTide® LL树脂,合成规模为0.05或0.1毫摩尔。脱保护步骤使用DMF中的吡咯烷进行处理。偶联反应则通过使用10或20当量的Fmoc保护氨基酸与DIC和Oxyma Pure在DMF中反应(遵循改良的CarboMAX方案)。蛋白质的切割在室温或38°C下进行,使用的是TFA/H2O/TIS/DODT混合物。切割完成后,蛋白质通过乙酉迷沉淀并经过夜冻干处理以获得最终产品。


蛋白质纯化


蛋白质通过装备有Intrepid C18, 21.2 mm x 250 mm, 5 μm色谱柱的Prodigy系统上的高温HPLC进行纯化。粗蛋白首先溶解在水中并过滤后注射进样。分离在40或60°C下进行,使用含有0.1% TFA的(i)水和(ii)乙腈的梯度洗脱。


蛋白质分析


蛋白质在装备有Q Exactive plus MS的ThermoFisher UPLC系统上进行分析,使用Acquity UPLC BEH C8色谱柱(1.7 mm x 100 mm)。峰分析在Chromeleon软件上完成。分离使用含有0.05% TFA的(i)水和(ii)乙腈的梯度洗脱进行。


成 果



表1. 每种蛋白质的合成时间和产生的废液总量

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表2. 每个蛋白质的氨基酸序列

加粗的DG表示使用了Asp(OtBu)-(DMB)Gly

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结 论


微波固相肽合成(Microwave SPPS)技术已证明是一种用于合成大型肽链和蛋白质的强大且高效的方法。在Liberty PRIME 2.0设备上进行的实验展示了其能力,成功合成了六种不同长度(从76至127个氨基酸)的蛋白质。这一自动化过程仅需10至17小时即可完成单个蛋白质的合成,并且目标蛋白质能够通过Prodigy系统的高温制备型HPLC迅速纯化出来。与天然化学连接或蛋白质表达的传统方法相比,这种快速且方便的替代方案提供了显著的效率优势。此外,Liberty PRIME 2.0和Liberty Blue 2.0系统具有高度适应性,可用于引入非天然氨基酸或制备特殊蛋白质。整个组装过程不仅速度快、效率高,而且产生的废物极少,显示出其*的环保性能。


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图1.泛素样品粗制(1、2)和纯化后(3、4)的UPLC-MS 分析

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图2.原胰岛素粗样品粗制(1、2)和纯化后(3、4)的 UPLC-MS 分析

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图3.芽孢杆菌RNA酶样品粗制(1、2)和纯化后(3、4)的 UPLC-MS 分析

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图4.艾滋病毒蛋白酶样品粗制(1、2)和纯化后(3、4)的 UPLC-MS 分析




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图5.胶原蛋白样品粗制(1、2)和纯化后(3、4)的 UPLC-MS 分析

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图6.MDM2样品粗制(1、2)和纯化后(3、4)的 UPLC-MS 分析


参考文献


[1] Hou, W.; Zhang, X.; Liu, C.-F., Progress in Chemical Synthesis of Peptides and Proteins. Transactions of Tianjin University 2017, 23 (5), 401-419.

[2] Hartrampf, N.; Saebi, A.; Poskus, M.; Gates, Z. P.; Callahan, A. J.; Cowfer, A. E.; Hanna, S.; Antilla, S.; Schissel, C. K.; Quartararo, A. J.; Ye, X.; Mijalis, A. J.; Simon, M. D.; Loas, A.; Liu, S.; Jessen, C.; Nielsen, T. E.; Pentelute, B. L., Synthesis of proteins by automated flow chemistry. Science 2020, 368(6494), 980-987.

[3] Bacsa, B.; Horváti, K.; Bõsze, S.; Andreae, F.; Kappe, C.O., Solid-Phase Synthesis of Difficult Peptide Sequences at Elevated Temperatures: A Critical Comparison of Microwave and Conventional Heating Technologies. J. Org. Chem. 2008, 73 (19), 7532-7542.

[4] Friligou, I.; Papadimitriou, E.; Gatos, D.; Matsoukas, J.;Tselios, T., Microwave-assisted solid-phase peptide synthesis of the 60–110 domain of human pleiotrophin on 2-chlorotrityl resin. J. Amino Acids 2011, 40 (5), 1431-1440.

[5] CEM: CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperatures. CEM Corporation Website, Application Notes.[Online]. Published Online: January 9, 2018.