多肽合成中偶联效率的 “断崖式下跌”原因以及应对策略

多肽合成中偶联效率的 “断崖式下跌"原因以及应对策略

在多肽固相合成中，肽链延长至一定长度后，部分氨基酸的偶联难度会出现 “突然跃升"，原因是肽链聚集效应叠加氨基酸自身的空间位阻 / 极性特征，导致反应位点被包裹、传质受阻。这类氨基酸可分为两类：高疏水性氨基酸和易形成二级结构的氨基酸，具体如下：

一、 高疏水性氨基酸：肽链延长后因聚集引发偶联难度陡增

当肽链长度超过 8–10 个残基时，疏水性氨基酸的侧链会通过疏水作用驱动肽链在固相载体表面发生折叠聚集，使得末端氨基被包裹在疏水核心内，活化羧基难以接近，偶联效率骤降。

1.       亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）

突变特征：短肽（<6 残基）中偶联难度中等，但当肽链中连续出现 3 个及以上这类支链疏水氨基酸，或肽链总长度超过 10 残基时，偶联效率会从 80% 以上骤降至 40% 以下。

2.       苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）

突变特征：肽链长度超过 8 残基，且序列中存在 2 个以上芳香族残基时，偶联难度会突然升高；Trp 还会因聚集导致氧化风险同步增加。

二、 易形成二级结构的氨基酸：肽链延长后因构象固定引发偶联难度突变

部分氨基酸易诱导肽链形成 α- 螺旋、β- 折叠等二级结构，当肽链延长至能稳定二级结构的长度时，末端构象被固定，氨基活性位点难以与活化酯接触，偶联难度突然上升。

1.       α- 氨基异丁酸（Aib）、丙氨酸（Ala）

突变特征：Aib 是强 α- 螺旋诱导剂，会快速形成稳定 α- 螺旋，导致后续偶联效率骤降。Ala 虽短肽中偶联极易，但在长肽中形成 α- 螺旋后，偶联难度也会显著上升。

2.       脯氨酸（Pro）

突变特征：短肽中 Pro 偶联难度高，但仍可通过高活性试剂解决；当肽链长度超过 8 残基且含 Pro-Pro 序列时，偶联难度会突然跃升，甚至出现肽链延伸停滞。

3.       谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）

突变特征：在长肽（>12 残基）中，带电荷的 Glu/Lys 易通过离子键交联形成聚集体，尤其当序列中正负电荷残基比例失衡时，偶联难度会突然升高。

应对策略：

1.       添加助溶剂：在 DMF 中加入 10%–30% DMSO 或 NMP，破坏肽链疏水聚集，提高反应位点可及性。

2.       微波辅助技术：

通过微波能量与特殊环形电磁场的协同作用，让卷曲的肽链充分展开，打破疏水聚集与二级结构的束缚，使反应位点更易被活化试剂接触，从而显著降低因肽链延长、氨基酸聚集或构象固定导致的偶联难度突变。同时，微波的快速能量耦合与精准控温，既能加速偶联反应、缩短时间，又能减少氧化、消旋等副反应，有效提升长肽与难点氨基酸序列的合成效率与产物纯度。

3.       微波方法优化：对于难偶联氨基酸循环，将方法中偶联次数翻倍。

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