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【ISCO】反相RediSep®柱在肽分离中的应用与优化

 更新时间:2024-11-19 点击量:217

一、应用概述

肽可以被定义为氨基酸的短链聚合物。单个肽的特性当然取决于其特定的氨基酸组成和排列方式。肽具有相对的极性,其结合特性与其他蛋白质相当一致。

肽混合物可以被分离成单个肽种类。如果可以将这些单独且更具体的肽包含在一个单一的馏分中,这将极大地加速许多科学过程。

以下是一个通用的方法,用于在可重复使用的反相RediSep® C18柱上将肽混合物分离成馏分。

通常最好从4.3克的RediSep反相柱开始。在探索特定肽的良好参数时,会使用较少的肽样品和溶剂。一旦确定了洗脱参数,就可以根据需要扩大过程规模。回顾反相理论的应用说明AN10可能是有益的。

对于本参考文献中使用的特定肽混合物,参数列于表1中。参数将随肽结构而变化。


表格1:通用方法参数

【ISCO】反相RediSep®柱在肽分离中的应用与优化


二、通用方法波长

理想的波长会根据肽的结构而变化。选择具有最高灵敏度的波长是理想的,同时避免引入过多噪声或遗漏某些化合物。如果210 nm过于嘈杂,那么214 nm通常会提供一个更干净的基线。环状结构在280 nm处吸收最好,双键在254 nm处,单键在210 nm处。推荐的通用波长对于蛋白质和肽是210 nm


反离子

为了提高肽和柱的性能,通常使用反离子。这有助于提供更均匀的分离,从而改善柱性能。常用的反离子是0.1%(体积比)三氟乙酉夋(TFA)。将其等量添加到AB移动相中。在整个分离过程中保持稳定离子浓度会得到更一致的基线。简单的配制方法是每升移动相中加入1毫升(0.1% v/v)。直接用移液管将TFA加入到移动相中并彳切底混合。


柱负载

这个参数根据肽的组成有很大的变化。对于4.3克的RediSep反相柱,0.5毫克应该是一个好的起点。


柱构造

柱本身由三个主要部分组成:

1. 支持介质是固定相所绑定的固体表面。

2. 固定相是附着在支持介质上的活性涂层,即C18

3. 移动相是流过支持介质的流体,以便将肽的活性部分暴露给固定相。


移动相或溶剂系统

许多肽强烈地吸附在C18上,通常需要一个强梯度来洗脱。典型地,水用作溶剂A,乙腈用作溶剂B来洗脱肽。


梯度

在建立新方法时,通常建议创建一个从095% B溶剂的非常缓慢的梯度,以确保所有峰都被洗脱并且柱子被清洁。

在初始的0-95%梯度运行后,洗脱轮廓大致确定,可以根据特定肽的需要修改梯度。通过在特定的保留时间改变梯度的斜率,可以优化分离时间和峰形。


三、分析结果

1提供了一个参考肽的色谱图。特定的肽是使用表1中列出的参数进行分离的。参数将随着肽的结构而变化。


【ISCO】反相RediSep®柱在肽分离中的应用与优化

1:样品肽色谱图


四、总结

肽的纯化方法可以先在较小的柱上建立,然后根据所需的样品负载量进行放大。